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      新聞詳情

      免疫共沉淀解決方案你了解多少?

      日期:2022-05-31 01:52
      瀏覽次數:6951
      摘要: 在科研界,免疫共沉淀(Co-IP)無疑是磨人的小妖精,小師弟說總是分分鐘被虐的體無完膚,糟心的實驗結果更是讓實驗汪們分分鐘想去“狗帶”。 一. 實驗原理及優缺點 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。 免疫共沉淀的設計理念是,假設一種已知蛋白是某個大的蛋白復合物的組成成員,那么利用這種蛋白的特異性抗體,就可能將整個蛋白復合物從溶液中“拉”下來(常說的“pull-down”),進而可以...
      在科研界,免疫共沉淀(Co-IP)無疑是磨人的小妖精,小師弟說總是分分鐘被虐的體無完膚,糟心的實驗結果更是讓實驗汪們分分鐘想去“狗帶”。
      一. 實驗原理及優缺點
      免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。
      免疫共沉淀的設計理念是,假設一種已知蛋白是某個大的蛋白復合物的組成成員,那么利用這種蛋白的特異性抗體,就可能將整個蛋白復合物從溶液中“拉”下來(常說的“pull-down”),進而可以用于鑒定這個蛋白復合物中的其他未知成員。免疫共沉淀的特點可以概括為兩點,是天然狀態,**是蛋白復合物。
      標簽
      優點


      免疫共沉淀Co-IP

      1.相互作用的蛋白質是經翻譯后修飾的,處于天然狀態;


      2.蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響;


      3.可分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。


      1.可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;

      2.兩種蛋白質的結合可能有第三者在中間起橋梁作用;

      3.在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇后檢測的抗體,若預測不正確,實驗就得不到結果。



       二. 免疫共沉淀實驗步驟

      1.用RIPA裂解緩沖液裂解細胞;

      2.用PBS配制成50%的protein A/G-agarose工作液;

      3.在樣品中以每1ml中加100μl的比例,加入50%的Protein A/G agarose工作液。水平搖床4℃搖動10min(該步驟的目的是去除非特異性結合的蛋白);

      4.4℃,14000g離心15min,將上清轉移到一個新的離心管中,去除protein A/G-agraose微球;

      5.使用BCA法或者其他方法測定總蛋白的濃度;

      6.加入體積的一抗,至總體積約為500μl;

      8.用搖床緩慢搖動抗原抗體混合物,4℃過夜;注意:如果如果下游用于激酶或磷酸酶的酶活測定,則好將11步改為室溫孵育2h;

      9.14000g離心5s,收集沉淀,并且用預冷的洗滌緩沖液(或者預冷的PBS)洗滌3遍(每次加入800μl)

      10.(用合適體積的上樣緩沖液重懸)收集上清,用于進一步的下游SDS-PAGE、western-blot或者質譜分析。通過免疫共沉淀,確定結合蛋白。

      三.常見問題解解決辦法

      1、抗體洗脫過多,怎么辦?

      解決辦法:降低抗體用量;在進行IP前將抗體交聯到珠子上;使用梯度甘氨酸緩沖洗脫液。

      2、洗脫液中檢測不到靶蛋白,怎么辦?

      原因
      解決辦法
      標本中無靶蛋白表達,或者表達量非常低
      根據蛋白表達資料確定檢測標本中有靶蛋白的表達。如果蛋白表達水平很低,可以考慮增加裂解物的用量,但這樣會增加非特異性結合。因此建議在進行IP前先對裂解物進行預純化
      所有抗體量不足,難以捕獲靶蛋白
      根據推薦量使用抗體,并根據實驗結果優化抗體的用量.
      靶蛋白沒有從珠子上洗脫下來
      確定使用正確的洗脫液并洗脫液的強度和pH值是適用于靶蛋白的
      抗體沒有和免疫吸附的珠子結合
      確定使用正確的洗脫液并洗脫液的強度和pH值是適用于靶蛋白的
      抗體沒有和免疫吸附的珠子結合
      根據說明書確定該抗體檢測的是變性還是天然蛋白;然后所用裂解液是恰當的

      3、未檢測到目得蛋白或蛋白很少,怎么辦?
      原因
      解決方法
      樣品被蛋白酶降解
      添加蛋白酶抑制劑,所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融;
      抗體濃度太低
      調整IP和或IB抗體濃度,必要時設立濃度梯度,摸索佳濃度;
      抗體親和力太低
      用審核與IP或IB的相應抗體
      IP抗體未與agarose珠子結合
      用適合于IP的相應珠子,正存防止變質或干燥
      裂解液嚴謹度太高
      用低嚴謹度裂解液

      4、目得蛋白高背景,怎么辦?

      原因
      解決辦法
      吸取了不溶于去污劑中的蛋白(沉淀)
      離心后立刻吸取上清,如果發生了重懸,則需要再次離心
      洗滌不
      在洗滌過程中將試管蓋好蓋子,倒轉混勻幾次洗滌充分后再離心
      非特異蛋白結合到珠子上了,珠子沒有被充分封閉。
      確定使用所有BSA(fraction V)是新鮮配制的,用1%BSA的PBS封閉新鮮準備的珠子1hr。進行IP前使用PBS洗滌3-4次
      所用抗體純度不夠
      使用親和純化的抗體,有限預吸附過的抗體
      非特異性蛋白結合
      在無血清培養液中裂解細胞,在免疫沉淀錢用protein(G/A)珠子預洗免疫沉淀后增加漂洗次數和嚴謹度(高鹽或去垢劑)
      在免疫沉淀過程中蛋白降解
      本裂解時使用新鮮配制的蛋白抑制劑
      實驗儀器或液體被污染
      使用結晶的儀器或液體

      5、免疫沉淀應該如何配制細胞裂解液? 

      答: 細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用或抗原的結構,多采用非離子變性劑(NP40 或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑。


      四. 應用

      1、腫瘤:鼻咽癌細胞中P53相結合蛋白質的分離和鑒定:免疫共沉淀與LC2ESI2MS/MS分析相結合的方法對HNE1細胞蛋白條帶3鑒定的P53相互作用蛋白之一HSP78進行了驗證。次在鼻咽癌細胞中鑒定了九個P53結合蛋白,為闡明鼻咽癌中P53蛋白聚集及失活的機制提供了重要依據和線索。

      2、酶和病毒:應用免疫共沉淀技術驗證新基因AngRem104和糖皮質**受體特異延伸因子蛋白在哺乳動物細胞中的相互作用,為進一步研究AngRem104的生理功能奠定基礎。
      3、信號轉導:通過免疫共沉淀證實了黑色素瘤相關抗原MAAT1p115與LRP6之間的相互作用。
      4、寄生蟲:免疫共沉淀證明了天然的PfPP5和惡性瘧原蟲的熱休克蛋白90之間的相互作用,PfPP5在惡性瘧原蟲寄生生長和信號途徑過程中起決定性作用。


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